ELISA试剂盒开发

    ELISA试剂盒法检测具有高效、快捷、易批量操作等优点，不同的生产厂家提供不同种类，不同类型的Elisa试剂盒产品，为科研用户带来极大的方便。诺梵生物能够针对特定检测源，制备特异性抗原抗体，根据应用需要量身定制检测试剂盒，有效控制检测试剂成本。

    我们恪守ELISA试剂盒开发的八大质控原则，成功的为水产、畜禽疫病检测科研用户开发高敏、经济、实用的疫病检测试剂盒。

第一部分: 项目沟通

了解项目背景及预期目标确定开发方案及计划。可根据您的个性化需要开发特定ELISA 试剂盒。可采用ELISA夹心法、竞争法（测定抗原）、间接法（测定抗体）或竞争法（测定小分子化合物）定量检测目标物的含量。

第二部分：免疫原制备

1、 分析目标蛋白的基因和氨基酸序列，进行抗原性及表达分析，密码子优化，完成全基因合成。

2、 构建重组蛋白的原核表达载体。

3、 转化E. Coli体系,进行重组蛋白表达诱导和镍柱亲合纯化，获得1～3mg纯化重组蛋白，纯度>85%。（如需需要真核表达系统表达，诺梵生物亦可提供相关服务）

4、 制备免疫原用于动物免疫。

如为小分靶标，则通过结构分析进行分子修饰并偶联载体蛋白用于免疫及检测。

第三部分：制备抗体

根据项目沟通结果确定制备抗体的种类，一般夹心ELISA需要不同表位的抗体用做配对，建议同时进行多克隆抗体和单克隆抗体的制备。确保高效的获得最高灵敏度的配对方式。其他类型的ELISA根据具体情况选择。

1、 实验动物免疫

使用第一部分制备的免疫原免疫2只新西兰兔和5只BALB/c鼠分别用于多克隆抗体及单克隆抗体的制备。免疫4-5次，收集抗血清检测效价，ELISA效价大于10万以上进行多克隆抗血清收集及单克隆抗体杂交瘤制备。

2、 单克隆抗体杂交瘤制备

选择与重组蛋白和天然蛋白免疫反应最强的小鼠进行细胞融合，通过ELISA筛选阳性克隆，将阳性克隆进行亚克隆获得阳性细胞株。将阳性克隆上清进行表位鉴定，反应性鉴定及亲和力鉴定。选择不同表位，反应性强且亲和力高的细胞株进行后续抗体生产。

3、 抗体生产

多克隆抗血清进行抗原亲和纯化，获得特异性抗体10-20 mg。

单克隆抗体生产选择所需阳性细胞株进行细胞扩增，腹水制备，通过蛋白A亲和纯化获得3-5 mg 纯化抗体。

第四部分：ELISA 试剂盒制备

1、 抗原或抗体标记

根据开发ELISA的类型确定标记抗原或者抗体。一般标记HRP 或者生物素。

2、 抗原抗体使用浓度优化

检测不同浓度抗原与抗体的反应灵敏度，特异性。确定最优的抗原与抗体的使用浓度。

3、 包被条件及反应条件优化

确定包被缓冲液，洗涤缓冲液及酶结合物保存液；确定抗体反应温度及反应时间。

4、 回收率测定

将标准品加入阴性样品中确定回收率，需达到80%-120%的回收范围。

5、 批间差及批内差测定

重复性检测，批间差及批内差需小于15%。

6、 稳定性测试

通过37度破坏性试验检测试剂盒在37度条件下3天，7天，10天，14天的表现。同时4度留样以备长期检测。一般试剂盒可在4度存放1年。

7、 临床样品或真实样本检测

将客户提供的其他方法验证的阳性样品和阴性样品进行重复验证检测，确定符合率。

8、 试剂盒组装

组装5份ELISA试剂盒包括所有组分及说明书。

9、技术服务合同书：ELISA试剂盒定制服docx.rar