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技术研发 >> 蛋白定制服务
重组蛋白GMP生产服务;

真核和原核重组蛋白表达,我们进行蛋白基因序列优化,以提高目的蛋白高效表达和正确折叠,交付纯化后的重组蛋白的纯度≥ 95% by SDS-PAGE,根据客户要求去除内毒素,一般低于0.01 EU/μg,满足细胞实验,或者体内功能实验。

作为基因免疫技术的辅助平台,我们建立了多样化的重组蛋白表达系统,包括:

(1)HEK293真核细胞表达系统;

(2)大肠杆菌E.coli原核细胞表达系统;

(3)杆状病毒Baculovrius昆虫细胞表达系统;

(4)酵母Pichia Yeast表达系统,可生产难以表达且具有天然构象和生物活性的蛋白。

同时我们也提供重组蛋白纯化和标记服务,以专业的技术方法提高实验成功率,减少蛋白操作过程中损失,我们在生产过程中将严格按照相应的SOP及QC标准执行,在项目结束后我们将向客户提供总结报告,包括实验流程及各节点有关实验数据。

NOVINBIO的重组蛋白高效表达系统,由多位从事细胞工程二十多年的专业人员主持,从表达载体的设计、新型转染制剂与条件的优化、宿主细胞的增效处理,到蛋白纯化策略,都积累了丰富的经验,可生产难以表达且具有天然构象和生物活性的蛋白。通过严格的质量控制体系,生产的蛋白具有纯度高、毒性低的特点,可用于生物医学检测和体外诊断试剂,生物医学功能的研究,疫苗的基础和临床前研究,其它生物医学研究和应用。为了满足不同客户(工业客户和一般研究者)的需求,NOVINBIO推出多种蛋白服务套餐,为客户节约成本和时间的同时,最大限度的满足客户实际需要。

 

服务优势

●能实现翻译后修饰及正确的蛋白折叠复性

●稳定及瞬时蛋白表达

●高效启动子(CMV, SV40)控制蛋白表达

●表达水平高

●大规模蛋白表达

 

步骤1. 目标基因全基因合成:

1.从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。

2.根据选用的表达系统对cDNA进行密码子,mRNA二级结构等的优化。

3.合成设计好的基因序列。

交付内容:目的基因(在T载体或常规穿梭载体上)及测序报告。

时间:2-3周

 

步骤2.:目标基因亚克隆到哺乳动物细胞表达载体

1.扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。

2.将目标基因亚克隆到真核表达载体上。

3.测序验证构建质粒的准确性。

4.通过中抽获得重组的质粒DNA

交付内容:正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序报告。

时间:2周

 

步骤3. 小量转染并通过Western-blot检测表达:

1.利用转染试剂将重组质粒转入合适的哺乳动物细胞中。

2.从转染后24到72小时,每12小时取样,通过SDS-PAGE和Western-blot检测目标蛋白表达情况。

3.可提供表达细胞株:293,293T,NIH/3T3,COS-7,CHO。

交付内容:目标蛋白表达结果。

时间:2周

说明:

1. 如果转染不成功,则不收取费用。如果没有检测到目标蛋白表达,也要收取80%实验费用。

2.每次Western-blot检测最多7个样品,因为要加入阳性对照,阴性对照以及Marker。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗,如果客户需要使用其他一抗,则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响,因此我们并不能确保检测结果(可能会出现假阳性或? 是假阴性的结果)。如果结果不正常,我们可以免费重做一次。

 

步骤4. 目标蛋白表达及纯化:

1.培养500ml哺乳动物细胞,然后将重组质粒转染到细胞中,通过瞬时表达产生目标蛋白。

2.收集含有目标蛋白的部分(细胞或培养上清)。

3.通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。

4.通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。

5.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

交付内容:纯化好的目标蛋白及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度最高可达90%以上。

时间:3-4周

说明:

1. 如果没有获得目标蛋白,则不收取任何费用。如果最终得到的产品未达到合同要求而客户又同意接受该产品,则双方协商本步骤费用。

2. 如果客户需要详细的纯化工艺,包括详细纯化条件及每步结果,则需要加收100%相应费用。

3. 因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同,我们最终根据实际情况将给客户提供最少0.1mg,最多2mg的目标蛋白,所收取的费用是相同的。

4. 我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液(Tris-HCl,PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液)中蛋白质溶液,并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统,所以我们无法保证最终产品的生物学活性,不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。如果客户一定要求目标蛋白活性,我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格,我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30% ,而如果样品活性合格,我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。

5. 每次Western-blot检测最多7个样品,因为要加入阳性对照,阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测,如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗,如果客户需要使用其他一抗,则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响,因此我们并不能确保检测结果(可能会出现假阳性或是假阴性的结果)。如果结果不正常,我们可以免费重做一次。

 

步骤5. 目标蛋白的再加工及详细检测:

1.内毒素去除,除菌,冻干等进一步加工。

2.通过HPLC,质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。

服务内容:

1:除内毒素,

2:过滤除菌,

3:冻干,

4:HPLC检测,

5:质谱检测,

6:N端测序。

交付内容:加工后的终产品及相关实验和检测报告。

时间:2周

 

步骤6. 筛选稳定高表达细胞株:

1.将转染后的哺乳动物细胞团转到96孔细胞培养板内,然后加入含有MTX的培养基。

2.当细胞长到大约2/3孔时,取培养上清检测表达。

3.挑出高表达的细胞团用于下一轮筛选,并在下一次细胞培养基中提高MTX的浓度。

4.重复加压筛选过程,提高细胞株的表达量直到获得合适的稳定表达株。

5.通过SDS-PAGE电泳检测每步表达结果。

6.通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

交付内容:稳定的高表达细胞株及筛选报告。

时间:6-8周

说明:因为每个重组蛋白的表达量受多种条件影响,我们并不能保证最终稳定株的表达量,但一般只有瞬时表达时表达量的1/10左右。

 

步骤7. 大规模制备:

按照小试工艺放大生产规模,制备客户需要的合格蛋白产品,可以按要求制备GMP级别的蛋白。

交付内容:合格的目标蛋白及服务报告。

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