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技术研发 >> 蛋白定制服务
稳定细胞系构建服务;

诺梵具有全面的稳定细胞系开发能力,从您提供的基因序列开始,经过基因构建、细胞转染、cell pool筛选,直至筛选到稳定高表达的单克隆细胞株。高表达稳定细胞系的筛选需要通过多水平的分析和考量,我们会从细胞水平、蛋白表达水平和基因水平进行评价分析,帮您筛选出最优的单克隆。我们的高表达稳定系构建,产量可达克级每升。

服务内容

·     交付内容:高表达单克隆细胞株(1×107cells/ml,1ml)或 cell pool(1×107cells/ml,1ml);克隆载体;质检报告;实验流程报告;

·     周期:cell pool,8周;单克隆细胞株,12周

稳定细胞系筛选流程

1. 细胞准备

提前两周准备CHO细胞,保证细胞处于高活力和良好的状态

2. 质粒构建

您提供序列,我们进行密码子优化,基因合成,构建质粒。在稳定转染之前,我们会先瞬时转染表达评估。

3. 转染

电转,提前准备细胞,质粒,和确定转染条件。
电穿孔转染原理:通过电场作用,在细胞膜上暂时形成小孔或开口,把大分子如DNA等导入细胞并最终进入细胞核中。在电击过程中,细胞膜上出现穿孔,质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触,并与细胞膜上电穿孔区域形成一种可转移的复合物。再次电击后,质粒脱离复合物进入细胞质内,开始瞬转,同时小部分质粒进入核内与染色体整合,开始稳转。DNA进入细胞,细胞膜上的小孔可自动重新闭合。

4. Cell pool筛选

转染48小时之后,使用筛选培养基进行cell pool的筛选。培养,并挑选高表达的cell pool,放大培养,冻存高表达的cell pool。

5. 加压筛选单克隆

挑选最高表达的cell pool,有限稀释法进行单克隆筛选,铺板密度为0.5-1 cell/well,铺板15天后,显微镜观察,标记单克隆,挑选阳性克隆,进行批培养和稳定性检测。

我们选用GS系统,MSX筛选,逐渐提高药物的浓度,进行多轮次的压力筛选,以提高基因的表达水平。

6. 表达量评估

将96孔板细胞扩增至六孔板,按4×105cells 接种,一周后收集上清进行检测,评估表达量,根据检测结果,挑选10个最高表达的克隆进行批培养和稳定性测试。

7. 批培养&稳定性测试

相同密度细胞接种到摇瓶,每天取样计数,进行ELISA检测,确认生长和表达曲线。相同密度的细胞接种到摇瓶,每隔48小时,取样计数,按照相同的密度继续接种,最后进行ELISA检测,确认细胞表达稳定性。稳定性测试进行50代。

GS谷氨酰胺系统的原理

谷氨酰胺合成酶是一种能将谷氨酸和氨合成为谷氨酰胺的酶。这种酶促反应是动物细胞获得谷氨酰胺的途径。
谷氨酰胺酶在哺乳动物的生长培养基中扮演者非常重要的角色,一些哺乳动物系在没有添加谷氨酰胺的培养基中无法表达足够的谷氨酰胺来维持生存。在这些细胞中转染GS基因可以在没有谷氨酰胺的培养基中作为选择标记来获得增殖。其他细胞系,如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,表达足够的GS离不开外源提供谷氨酰胺。在这种情况下,GS抑制剂,L-氨基亚砜蛋氨酸(MSX),可抑制内源性活性,只有转染了额外的GS基因才可以生存。
CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶(dhfr),无法自身合成四氢叶酸,只能在添加了次黄嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧啶(Thymidine)和甘氨酸的培养液中才能存活。

而通过目的基因与dhfr基因共转染,不仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆,更为重要的是由于dhfr可被叶酸类似物氨甲喋呤(MTX)所抑制,在MTX浓度选择压力下,dhfr基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存,从而得到抗MTX细胞系;又由于与dhfr基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域,所以外源重组蛋白的序列片段也随着dhfr基因的扩增而扩增。

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