产品简介

2019年底由新型冠状病毒引起的肺炎疫情，从2020年初开始在全球大流行，感染病例快速上升，引发全球关注。该病毒被世界卫生组织(WHO)命名为2019-nCoV，被国际病毒分类委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。由新型冠状病毒导致的疾病，被世界卫生组织正式命名为冠状病毒疾病2019 (Corona Virus Disease 2019, COVID-19），通常称为新型冠状病毒肺炎，简称“新冠肺炎”。

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)、严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病以及新冠肺炎COVID-19。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。

本试剂盒以新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因中的保守区为靶点，参考中国疾病预防控制中心提供的新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列，并经过优化而研发的新型冠状毒核酸检测试剂盒。每条检测探针的5'端标记FAM或HEX荧光基团，3'端标记TAMRA或BHQ1淬灭基团。扩增之前探针上的淬灭基团由于空间上的荧光共振能力转移(FRET)而导致荧光基团淬灭。PCR反应时，引物和探针都会退火到目标基因上，随着引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性会导致结合在目标基因上的探针从5'端开始逐渐被降解。探针的荧光基团和淬灭基团被Taq酶切开后，淬灭基团的作用消失，荧光基团就能正常地被激发光所激发而产生荧光。每经过一个PCR循环，就会有更多的荧光基团被释放，荧光强度与新合成的目标片段数量成正比，荧光定量PCR仪可根据检测到的荧光信号绘制出实时扩增曲线，从而实现对新冠状病毒(2019-nCoV)在核酸水平上的检测。

本试剂盒包含了M-MLV反转录酶、Taq DNA Polymerase、引物、探针、PCR Buffer、dNTPs、稳定剂、Nuclease-free Water和镁离子等所有的通用组分，操作更简单、使用便捷，用户只需自备样品RNA即可。

本试剂盒适用于具有FAM和VIC/HEX/JOE检测通道的荧光定量PCR仪，如ABI的7500、7900、StepOne、QuantStudio系列，Roche的LightCycler480、SmartCycler，Bio-Rad的CFX96、Chromo4、Opticon 2、iCycler IQ、iQ5，Qiagen的Rotor Gene 6000，上海宏石SLAN-96P等。

本试剂盒配有免核酸提取释放剂，可以与市场上的非灭活型病毒保存液兼容，可以免RNA抽提而直接用于病毒的核酸检测，使用非常便捷。灭活性保存液保存的新冠病毒，可以使用本公司病毒RNA抽提试剂盒(离心柱式)提取病毒后检测。

试剂盒组成

保存条件

-20oC避光保存，一年有效。尽量避免反复冻融。

注意事项

本试剂盒并非临床诊断检测试剂盒，检测结果仅供科学研究用途，不得作为临床诊断的依据。但感兴趣的用户可以与我们合作，使用本试剂盒作为原料，研发和申报相应的临床诊断检测试剂盒。

样本灭活(如56oC、45分钟)很可能会使检测结果的Ct值增加1-2。

TaqMan One Step EnzymeMix含有高浓度甘油，粘度高，使用前须将所有液体短暂离心至管底，然后缓慢准确吸取。

使用前须确保Reaction Buffer完全融化，并且上下颠倒混匀至少3次后使用。

使用前须确保2 x TaqMan One Step Buffer完全融化，并且上下颠倒混匀至少3次后使用。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

1. 需要用户自己准备的耗材、仪器和试剂

a. 具有FAM和HEX荧光通道的荧光定量PCR仪。

b. DNase-free、RNase-free的吸头、离心管、荧光定量PCR管。

c. 生物安全柜。

d. RNA提取试剂盒。推荐使用本公司的病毒RNA抽提试剂盒(离心柱式)。

2. 样本准备

a. 本试剂盒适用样本类型：上呼吸道标本(包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳液)；下呼吸道标本(包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本)；组织培养物等样本。

b. 样本采集具体方法请参考“2019新型冠状病毒核酸检测专家共识”和“新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南”。

c. 样本采集后，可保存在病毒样品保存液中，保存时间按规定执行。推荐但应避免反复冻融。也可以使用本公司的灭活或非灭活保存液进行保存，室温可以保存7天左右。

d. 将样品按照病毒RNA提取试剂盒中相应的要求和步骤进行RNA提取，提取的RNA可直接用于检测。若提取后不立即检测， 也可保存于-70oC备用，同时应尽量避免反复冻融。

f. 核酸检测的各个步骤需要在指定区域进行，以避免交叉污染。例如样本处理、加样在样本处理区，扩增试剂准备在PCR前准备区，核酸扩增在检测区。

注：1.如样品保存的是非灭活病毒保存液，可以取20ul保存液，加5ul的Ultra-fast Release Reagent，轻柔混匀，室温放置10min，取上清直接进行后续核酸检测试验。

2.如病毒保存的是灭活保存液，则可以选择本公司的病毒RNA提取试剂盒进行核酸提取，已进行核酸检测。

3.如果是直接保存到本公司的核酸释放剂中的，则可直接取样进行核酸检测。

3. qRT-PCR反应体系的设置 a. 融解并混匀反应所需的各种溶液，置于冰浴上或冰盒内。 b. 参考下表在室温或冰浴上设置qRT-PCR反应体系(以96孔板，每孔反应体系为25μl为例)。下表中的Template RNA为样品 RNA、试剂盒中提供的Negative Control或Positive Control。建议每次检测都设置阴性对照(Negative control)和阳性对照 (Positive control)。

c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。

d. 将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。

e. 荧光检测通道的选择：ORF1ab基因荧光基团是FAM，可选择检测通道(Reporter)为FAM，淬灭基团(Quencher)是TAMRA，如果没有TAMRA，则选择无；N基因荧光基团是VIC，可选择检测通道为VIC/HEX/JOE，淬灭基团是BHQ1，如果没有BHQ1，则选择无。请将仪器的荧光内参设置为“None”。

4. qRT-PCR反应程序

本试剂盒建议采用如下的qRT-PCR程序：

a. 反转录：50oC 20min

b. 预变性：95oC 2min

c. 变性：95oC 15sec

d. 退火/延伸：60oC 20sec

e. 重复步骤c和步骤d，总共45个循环

f. 最后使用荧光定量PCR仪提供的软件分析检测结果。

5. 结果的定性判断

a. 阳性对照：呈典型S型扩增曲线且Ct值≤33。

b. 阴性对照：无典型S型扩增曲线或Ct值>38。

c. 阳性：如果待测样本检测结果VIC通道和FAM通道均Ct值≤35，则可判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阳性。

d. 阴性：如果两个通道检测Ct值无数值或Ct值>38，且阳性对照品检测结果为阳性，此次结果判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阴性，但不排除其它冠状病毒感染的可能。

e. 可疑：如果待测样本35<Ct值≤38，则此样本应重新提取核酸后再次进行检测。如重复检测结果显示两个通道Ct值均≤35，则判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阳性；如两个通道检测Ct值无数值或Ct值>38，则判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阴性；如其中任一通道35<Ct值≤38，则该样本为可疑样本，应通过其它方法如测序进行进一步的分析和测。