说明书下载：Ni琼脂糖凝胶 产品规格：10ml 产品价格：220元 保存条件：20%乙醇中2-8℃保存。 产品简介： Ni NTA Beads是以4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸（NTA），螯合镍离子（Ni2+）后，可以形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构保护了镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件，较只有3 个螯合位点的Ni-IDA 结合Ni2+更为牢固，更有效防止纯化过程中Ni2+ 脱落且增强对His 标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。 支 持 物： 4%琼脂糖微球 载 量：30-40mgHis 标签蛋白/ml 填料 粒 径： 45-165 μm 注意事项： 1. 缓冲液中不建议使用β-巯基乙醇、DTT 和EDTA。 2. 为提高纯化效率，首先确定结合buffer和洗脱Buffer 中咪唑的最佳使用浓度。可以使用线性或梯度浓度的咪唑（20-500mM）洗脱蛋白，并通过SDS-PAGE 或WesternBlotting 来检测目的蛋白的纯度。 3. 请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过 0.45μm 过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.45μm 过滤器过滤。 操作步骤： 组装层析柱 1. 将填料混匀后加入层析柱，室温静置10 分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。 2. 向装填好的柱中加入 5 倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10 倍柱体积的结合 Buffer 平衡柱子，平衡结束后即可上样。 注意：柱体积指的是填料的体积。 I 可溶性蛋白的纯化（可溶性结合Buffer和可溶性洗脱Buffer配方详见配方1） 1. 收集菌体后，每100mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液，超声裂解菌体。 2. 将菌体裂解液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。 3. 使用15倍柱体积的S可溶性结合Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。 4. 使用5倍柱体积的可溶性洗脱 Buffer洗脱，收集洗脱峰。 5. 洗脱后，依次使用3倍柱体积的可溶性结合 Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），4℃保存。 II 包涵体蛋白的纯化（包涵体结合Buffer和 包涵体洗脱Buffer配方详见配方2） 1. 收集菌体后，每100mg菌体（湿重）加入1-5 ml 细菌裂解液，超声裂解菌体。 2. 离心，弃上清，将沉淀重悬于可溶性结合 Buffer 中（如有需要，可进行超声波处理）。 3. 重复操作2，直至包涵体清洗干净（呈较洁净的乳白色状）。 4. 将沉淀重悬于包涵体结合 Buffer中，冰浴1小时，使包涵体溶解。 5. 10,000×g离心20分钟，将上清以孔径为0.45 μm的滤膜过滤。 6. 将蛋白溶液负载上柱，流速为10倍柱体积/小时。 7. 使用15倍柱体积的包涵体结合Buffer冲洗柱子，收集流穿峰。 8. 使用5倍柱体积的包涵体洗脱 Buffer洗脱，收集洗脱峰。 9. 洗脱后，依次使用3倍柱体积的包涵体结合 Buffer和5倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），4℃保存。 注意：在纯化包涵体蛋白时，所有缓冲液均含有变性剂，需要降低结合Buffer 中的咪唑浓度（5mM 或更低）。洗脱时，若蛋白在较高pH下洗脱失败，可以选用低pH 缓冲液作为洗脱缓冲液（pH6.5，pH5.9 或pH4.5）。 柱再生 当填料使用多次后，结合效率会有所下降（表现为流速变慢或填料失去蓝绿色），可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。 1. 使用 2 倍柱体积的6M 盐酸胍冲洗后，使用3 倍柱体积的去离子水冲洗。 2. 使用 1 倍柱体积2% SDS 冲洗。 3. 依次使用 1 倍柱体积的25%、50%、75%和5 倍柱体积100%乙醇冲洗，再依次使用1 倍柱体积的75%、50%、25%的乙醇冲洗。 4. 使用 1 倍柱体积的去离子水冲洗。 5. 使用 5 倍柱体积含50 mM EDTA 缓冲液（PH8.0）冲洗。 6. 使用 3 倍柱体积去离子水，3 倍柱体积20%乙醇冲洗。 7. 4°C 保存。 8. 再次使用前，需首先使用 10 倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5 个柱体积的50 mM NiSO4 再生，3 个柱体积的Binding Buffer 平衡。 附配方： 配方1：可溶性蛋白纯化缓冲液配方 可溶性结合 buffer：20mMTris-HCl（PH7.9）、10mM咪唑、0.5MNaCl 可溶性洗脱 buffer：20mMTris-HCl（PH7.9）、500mM咪唑、0.5MNaCl 配方2：包涵体蛋白纯化缓冲液配方 包涵体结合 buffer：20mMTris-HCl（PH7.9）、5mM咪唑、0.5MNaCl、8M/6M尿素/盐酸胍 包涵体洗脱 buffer：20mMTris-HCl（PH7.9）、500mM咪唑、0.5MNaCl、8M/6M尿素/盐酸胍 |
