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产品信息 >> 核酸相关 >> 吸附柱法核酸提取试剂盒;
质粒小量抽提试剂盒

产品规格:50次

保存条件:干燥、室温(15-25℃)保存,一年有效。

自备试剂:无水乙醇

包装清单:

产品编号

产品名称

包装

1

溶液I (悬浮液)

15 mL

2

溶液II(裂解液)

15 mL

3

溶液III (结合液)

20 mL

4

溶液IV (洗涤液)

18mL(按要求加无水乙醇)

5

溶液V (洗脱液)

3mL

6

RNase A (100mg/ml)

15μl

7

小抽质粒纯化柱

50个

8

废液收集管

50个

9

说明书

1份

产品简介:

本试剂盒是用于质粒DNA小量制备与纯化的试剂盒。菌体先经碱裂解法处理,再通过离心吸附柱,专一结合DNA,最后洗去杂质,高效快速提取质粒DNA,全套操作可以在30分钟之内完成。使用本试剂盒可从1-5 mL过夜培养的菌液纯化得到高达20 ug的高纯度质粒DNA(OD260/OD280 = 1.8-2.0),可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。

注意事项

第一次使用前把试剂盒提供的RNase A全部加到溶液I (悬浮液)中,混匀,并在瓶上做好标记。加入RNase A后4℃存放可稳定保存6个月。

 第一次使用前在溶液IV (洗涤液)中按标签说明要求加入无水乙醇,混匀,并在瓶上做好标记。

 温度较低时,溶液II和溶液III可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀,37℃水浴加热溶解,混匀后使用。溶液II请勿过分剧烈混匀,否则会产生大量气泡,使用完后,一定要盖紧瓶盖,防止被空气中二氧化碳酸化。

 本试剂盒所有操作均在室温进行,操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。

 使用说明:

1. 取过夜菌1.5毫升,5000g离心1分钟收集细菌沉淀,弃上清。再重复一次,每管共收集3毫升过夜菌沉淀。

通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟,如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密,不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清,再倒入约1.5毫升菌液并重复上述操作,然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸),使液体流尽。如果细菌密度明显偏低,可考虑使用更多菌液,再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量一般不能超过5毫升,对于低拷贝质粒所用菌量一般不能超过10毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。

2. 每管加入250微升溶液I,重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开,无可见细菌团块。

确认溶液I中已经添加了RNase A。最高速度vortex 5-10秒或更长时间,悬起沉淀。一定要充分混匀,对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液,无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex,可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。

3. 每管加入250微升溶液II,轻轻颠倒离心管4-6次,使细菌完全裂解,溶液透明。

切勿vortex!vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂,易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后,溶液应变得透明,无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开,那么颠倒4-6次后,可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况,可以增加颠倒次数3-5次,再室温放置2-3分钟,但总裂解时间不可超过5分钟。

4. 每管加入350微升溶液III,随即颠倒离心管4-6次混匀,可见白色絮状物产生。

切勿vortex!颠倒次数也不宜过多,否则易导致最终所得质粒的质量下降。

5. 最高速(13,000rpm左右)室温离心10分钟。

离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱,废液收集管,并在纯化柱上做好标记。

6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30-60秒,倒弃收集管内液体。

质粒倒入质粒纯化柱后,可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。

7. 在质粒纯化柱内加入750微升溶液IV,最高速离心30-60秒,洗去杂质,倒弃收集管内液体。

加入溶液IV后可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。

8. 再最高速离心1分钟,除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

注意:倒弃收集管内液体后再离心,才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。

9. 将质粒纯化柱置于1.5毫升离心管上,加入50微升溶液V至管内柱面上,放置1分钟。

溶液 V 需要直接加至管内柱面中央,使液体被纯化柱吸收。如果不慎将溶液 V 沾在管壁上,一定要震动离心管,使液体滑落到管底,以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或 MiliQ 级纯水替代溶液 V,但是水的 pH 应不小于6.5。溶液 V 加入后放置时间稍长,对于增加质粒产量会略有帮助。

10. 最高速离心1分钟,所得液体即为高纯度质粒。

通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高浓度的质粒,可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。

说明书:质粒小量抽提试剂盒

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